Kartosuwiryo lahir di Cepu, sebuah kota kecamatan di Kabupaten Blora pada tanggal 7 Januari 1907. Ayahnya seorang mantri candu. Dimasa kecilnya, Kartosuwiryo diketahui memulai pendidikannya di Tweede Inlandsche School. Tamat dari sana, ia kemudian dikirim ke Rembang, Jawa Tengah di Hollandsch Inlandsche School. Tak lama kemudian orang tuanya kemudian menyekolahkan pemimpin Darul Islam itu di Europeesche Lagere School. Itu merupakan sebuah sekolah elit untuk anak belanda dan para bangsawan di Bojonegoro, Jawa Timur. Tamat dari sana, orang tuanya kemudian menyekolahkannya di Nederlandsch Indische Artsen School (NIAS), sekolah kedokteran yang berada di Surabaya. Disinilah ia kemudian mulai mengenal dan tertarik dengan dunia pergerakan. Dikutip dari buku Seri Tempo: Kartosuwiryo yang ditulis oleh Tim Buku Tempo (2016), disebutkan bahwa ide-ide kebangsaan bahkan cenderung ‘kiri’ diperolehnya dari buku bacaan sosialisme milik pamannya yang bernama Mas Marco Kartodikromo. Pamannya i
kumpulan khutbah dan ceramah di masjid an-nuur mulai dari tahun 1990-an ditujukan terutama untuk menasihati diri sendiri